Die Auswirkungen der NMDAR co

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13383 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Glutamatrezeptor vom N-Methyl-D-Aspartat-Typ (NMDAR) ist ein molekularer Koinzidenzdetektor, der korrelierte Muster neuronaler Aktivität in Hinweise für die strukturelle und funktionelle Verfeinerung sich entwickelnder Schaltkreise im Gehirn umwandelt. D-Serin ist ein endogener Co-Agonist des NMDAR. Wir untersuchten die Auswirkungen einer starken Verstärkung NMDAR-vermittelter Ströme durch chronische Verabreichung sättigender Mengen an D-Serin auf den sich entwickelnden retinotektalen Schaltkreis von Xenopus. Eine chronische Exposition gegenüber dem NMDAR-Co-Agonisten D-Serin führte zu strukturellen und funktionellen Veränderungen im Sehnervengewebe. In unreifen tektalen Neuronen führte die Verabreichung von D-Serin zu kompakteren und weniger dynamischen tektalen dendritischen Dornen und einer erhöhten Synapsendichte. Die Kalziumbildgebung zur Untersuchung der Retinotopie tektaler Neuronen ergab, dass Tiere, die mit D-Serin aufgezogen wurden, kompaktere visuelle Wahrnehmungsfelder hatten. Diese Ergebnisse geben Aufschluss darüber, wie die Verfügbarkeit endogener NMDAR-Co-Agonisten wie D-Serin an glutamatergen Synapsen die Verfeinerung von Schaltkreisen im sich entwickelnden Gehirn regulieren kann.

Während der Entwicklung funktioneller Schaltkreise erarbeiten und erstellen neuronale Prozesse grobe topografische Karten und werden dann einer synaptischen und strukturellen Verfeinerung unterzogen, um eine präzise Konnektivität zu ermöglichen1. Der Glutamatrezeptor vom N-Methyl-D-Aspartat-Typ (NMDAR) scheint eine evolutionär konservierte Rolle bei der aktivitätsabhängigen Auswahl von Inputs für die Verfeinerung zu spielen2. Während NMDARs in ihrer Zusammensetzung heterogen sind, erfordern sie klassischerweise die gleichzeitige Ligandenbindung von Glutamat und einem Co-Agonisten, entweder Glycin oder D-Serin3, sowie eine ausreichende Depolarisierung, um die Magnesiumblockade der Ionenkanalpore zu lösen4,5. Die gleichzeitigen Anforderungen an Ligandenbindung und Membrandepolarisation für die Kanalleitfähigkeit machen NMDARs ideal für die Erkennung der zeitlichen Korrelation konvergenter Eingaben6.

Dies legt ein Modell nahe, bei dem die NMDAR-Aktivierung strukturierte neuronale Aktivität in Signalkaskaden umwandeln kann, die die Verfeinerung topografischer Karten steuern. Es wurde gezeigt, dass korrelierte Aktivität die synaptische Stärkung vermittelt und die Stabilisierung des Axondorns fördert, die Zweiglebensdauer verlängert und die Zweigdynamik unterdrückt7,8,9. Umgekehrt fördert unkorrelierte Aktivität die Destabilisierung axonaler Zweige, einschließlich erhöhter Zweigzugabe, -verlust und -verlängerung10. In einer Reihe von Modellen stört der Verlust der NMDAR-Funktion das Wachstum des Dorns und die Dynamik von Axonen und Dendriten, was zu einer Desorganisation afferenter Projektionen während der Entwicklung topografischer Karten führt11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22.

d-Serin kommt endogen im Gehirn in einer ähnlichen Verteilung vor wie NMDARs23,24 und verstärkt die NMDAR-abhängige synaptische Übertragung25,26,27. D-Serin ist an der langfristigen Potenzierung des Hippocampus27,28,29,30 und Depressionen31,32,33 sowie an Aspekten des Lernens und des Gedächtnisses34,35 beteiligt. Ob im Nervensystem Glia oder Neuronen die Hauptquelle der D-Serin-Freisetzung sind, bleibt umstritten36,37,38 und hängt wahrscheinlich von der Gehirnregion, dem Entwicklungsstadium und dem Vorhandensein einer Pathologie ab39,40.

Die Rolle von NMDARs bei der Entwicklungsplastizität wurde größtenteils durch Manipulationen mit Funktionsverlust charakterisiert1,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,41,42, denen möglicherweise die Spezifität fehlt, wenn sie die normale Netzwerkaktivität stören, indem sie die gesamte neuronale Erregung reduzieren. Im Gegensatz dazu bietet die Verabreichung von D-Serin eine pharmakologische Manipulation, die bestehende NMDAR-Ströme verstärkt und gleichzeitig den Bedarf an Glutamatfreisetzung aufrechterhält43. Daher verwendeten wir die Verabreichung von D-Serin als Gain-of-Function-Manipulation, um die Auswirkungen der NMDAR-spezifischen Signalverstärkung auf die Schaltkreisentwicklung zu untersuchen.

Unter physiologischen Bedingungen wird die NMDAR-Funktion durch die Verfügbarkeit von Co-Agonisten moduliert43,44. Eine pharmakologische Blockade der Co-Agonisten-Bindungsstelle führt zu einem vollständigen Verlust der NMDAR-Leitfähigkeit, was den Wert solcher Experimente für das Verständnis der Beiträge von endogenem D-Serin zur Schaltkreisentwicklung einschränkt. Bei chronischer Exposition gegenüber sättigenden Mengen an D-Serin wird die endogene Regulierung der Verfügbarkeit von Co-Agonisten umgangen. Wir haben zuvor gezeigt, dass die exogene Verabreichung von D-Serin die funktionelle Reifung glutamaterger Synapsen durch den Transport von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure-Glutamatrezeptoren (AMPAR) fördert und die axonale Laubenstruktur in der Xenopus-Kaulquappe stabilisiert visuelles System43. Diese Studie befasste sich jedoch nicht mit den Auswirkungen der D-Serin-Aufzucht in der Entwicklung auf den postsynaptischen dendritischen Umbau, die Synaptogenese und die Feinabstimmung visueller Reaktionen. Hier verwenden wir eine chronische, sättigende Verabreichung von D-Serin, um die Struktur und Funktion postsynaptischer Neuronen im Sehnervengewebe zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Verabreichung von D-Serin zu einer kompakteren und stabileren dendritischen Dornmorphologie insbesondere in unreifen tektalen Neuronen führte, die Synapsendichte erhöhte und zu schärferen visuellen Empfangsfeldern im optischen Tectum führte.

Die Studie wurde vom Animal Care Committee des Montreal Neurological Institute der McGill University genehmigt. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.

Zur Erzeugung von Kaulquappen wurden weibliche erwachsene Albino-Xenopus laevis-Frösche (RRID: Nach 3 Tagen wurden diesen weiblichen Fröschen 400 IE menschliches Choriongonadotropin (hCG; Sigma-Aldrich CG10; RRID:SCR_018232) injiziert.

Den Männern wurden am selben Tag wie den Frauen 150 IE hCG injiziert und sie wurden zusammengelegt, um einen Amplexus auszulösen. Am nächsten Tag wurden die Eier gesammelt.

Eier von vorbereiteten Weibchen wurden für die In-vitro-Fertilisation mit Sperma von männlichen Albinofröschen gesammelt. Die Mikroinjektion von GCaMP6s und mCherry-Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) in ein Blastomer von Embryonen im Zweizellstadium wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt1,21. Kurz gesagt wurde eine Mischung aus gereinigter GCaMP6s (500 pg) und mCherry (250 pg) mRNA in 2 nL RNase-freiem Wasser mit einer kalibrierten Glasmikropipette, die an einen PLI-100-Picoinjektor angeschlossen war, unter Druck in ein Blastomer von Embryonen im Zweizellstadium injiziert ( Harvard-Apparat). Einige Tage nach der Injektion suchten wir nach Tieren mit hemilateral eingeschränkter mCherry-Expression und hoher GCaMP6s-Fluoreszenz zur Verwendung in Kalzium-Bildgebungsexperimenten. Da die Axone der retinalen Ganglienzellen (RGC) kontralateral zum Optikus Tectum projizieren, markieren GCaMP6s RGC-Axonterminals und postsynaptische Tektalzellen in gegenüberliegenden Hemisphären dieser Tiere, sodass wir eine Kalziumbildgebung entweder der RGCs oder der Tektalzellen in jedem Tektallappen durchführen können.

Für alle Experimente wurden Kaulquappen in Glasschüsseln aufgezogen, die in Inkubatoren mit biologischem Sauerstoffbedarf gehalten wurden, die auf 21 °C mit einem 12-Stunden-12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus eingestellt waren. Das Aufzuchtmedium war 0,1X modifizierte Barth-Lösung mit HEPES (MBSH; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,82 mM MgSO4 × 7H2O, 0,33 mM Ca(NO3)2 × 4H2O, 0,41 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4).

pCAG-Cre, pCALNL-EGFP und pCALNL-DsRed sind ein großzügiges Geschenk von CL Cepko und derzeit über Addgene erhältlich (Plasmide 13775, 13770, 13769). Alle Plasmide wurden in DH5a-kompetenten Zellen (Life Technologies) gezüchtet und unter Verwendung endotoxinfreier Maxiprep-Kits (Qiagen)45 gereinigt.

Um die mRNA für Blastomer-Injektionen zu synthetisieren, wurden GCaMP6s (Addgene-Plasmid 40753) und mCherry (Plasmid-Geschenk von K. Murai) jeweils in den pCS2+-Vektor kloniert. Das GCaMP6s-Plasmid wurde mit NotI/Klenow fill in/BglII geschnitten, das mCherry-Plasmid wurde mit BamHI/EcoRV geschnitten und der pCS2+-Vektor wurde mit BamH1/SnaB1 geschnitten. Für die mRNA-Synthese wurden die Plasmide mit NotI linearisiert und die verkappte mRNA von GCaMP6s und mCherry mit dem SP6 mMessage mMachine Kit (Ambion, Thermo Fisher) transkribiert.

Kaulquappen im Stadium 42–44 wurden in MS222 (0,02 % in 0,1 % MBSH) anästhesiert und unter einem Präpariermikroskop auf ein Kimwipe gelegt. Es wurde eine Cre-vermittelte Einzelzellmarkierung durch Elektroporation (CREMSCLE) für eine hocheffiziente, spärliche Markierung des optischen Tectums durchgeführt41. Für die tägliche Bildgebung (Abb. 1) wurden Cre-Rekombinase und Cre-abhängiges EGFP im Verhältnis 1:4000 (2,5 × 10–4 µg/µL pCAG-Cre, 1 µg/µL pCALNL-EGFP) zusammen intraventrikulär injiziert Schneller grüner Farbstoff zur Visualisierung. Um die Synapsen pro Zelle zu zählen (Abb. 3C, D), haben wir Cre-Rekombinase und Cre-abhängiges dsRed in einem Verhältnis von 1:4000 (2,5 × 10–4 µg/µL pCAG-Cre, 1 µg/µL pCALNL) gemeinsam elektroporiert -dsRed) und pPSD95-GFP (1 µg/µL). Unmittelbar nach den intraventrikulären Injektionen der Plasmide wurde ein Paar speziell angefertigter Platinplattenelektroden, verbunden mit einem Elektrostimulator (SD 9, Grass Instruments), auf jeder Seite des Gehirns platziert, um Stromimpulse abzugeben: 38 V, 1,6– 3 ms, 2 Impulse mit umgekehrter Polarität im Abstand von 1 s. Ein 3 µF-Kondensator wurde parallel geschaltet, um einen Stromimpuls mit exponentiellem Abfall zu erzeugen.

Während CREMSCLE verwendet wurde, um auf kleinere, unreifere Neuronen abzuzielen, verwendeten wir die Elektroporation von nebeneinander zellulären Einzelzellen46, um die Morphologien eines breiteren Spektrums tektaler Zellen zu untersuchen. Eine Borosilikatglas-Mikropipette (Sutter Instruments), die das Plasmid (1 µg/µL EGFP) enthielt, wurde vorsichtig in das Gehirn von anästhesierten Kaulquappen im Stadium 44–45 eingeführt. Eine 50-V-Reihe von 1-ms-Impulsen bei 200 Hz wurde 0,5 s lang durch die Mikropipette angelegt, wobei die Impulsfolgen zweimal wiederholt wurden, um die Abgabe des Plasmids zu erhöhen.

Wir verwendeten das zuvor veröffentlichte Versuchsprotokoll für die Verabreichung von D-Serin43. 48 Stunden nach der Elektroporation (Stadium 46–47) wurden die Tiere auf hell markierte, gut getrennte Tektalzellen untersucht und dann zur Aufzucht in eine isolierte Vertiefung zurückgebracht, die Kontroll-MBSH oder MBSH, ergänzt mit 100 µM D-Serin (Tocris), enthielt. oder MBSH mit 100 µM D-Serin und 10 µM MK-801. Tiere, die bis zu 3 Tage lang in diesen Medien aufgezogen wurden, wurden wie unten angegeben abgebildet.

Anregungslicht bei 910 nm (EGFP, GCaMP6s) oder 990 nm (dsRed) wurde von einem Mai Tai BB Ti:Sapphire oder einem InSightX3 Femtosekunden-gepulsten IR-Laser (Spectra Physics) erzeugt.

Die Tiere wurden auf helle, spärliche EGFP-Expression im optischen Tectum untersucht, in MS222 (0,02 % in 0,1X MBSH) anästhesiert, in eine speziell angefertigte Sylgard-Kammer gegeben, die zum Körper der Kaulquappe passte, und unter einem Deckglas gesichert. Z-Serienbilder einzelner tektaler Neuronen wurden täglich mit einem Olympus FV300-Mikroskop aufgenommen, das für die Multiphotonenbildgebung mit einem Olympus LUMPLAFLN 60X-Wasserimmersionsobjektiv (1,0 NA) modifiziert wurde. Optische Schnitte der Z-Serie wurden in Abständen von 1 µm mit der Fluoview-Software (Version 5.0) gesammelt. Nach der Bildgebung wurden die Tiere einzeln in die Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen in D-Serin oder Kontrollaufzuchtmedium gegeben. Vier Tage lang wurden jeden Tag Bilder gesammelt, wobei die Tiere in ihre jeweiligen Vertiefungen zurückgebracht wurden und das Aufzuchtmedium täglich gewechselt wurde. Alle Bild-Z-Stapel wurden mit der in MATLAB (MathWorks)47 implementierten nichtlokalen CANDLE-Entrauschungssoftware entrauscht, und dreidimensionale Rekonstruktionen einzelner Neuronen wurden mit Imaris 6.0 (Bitplane) durchgeführt. Einige Neuronen aus der Kontrollgruppe tauchten bereits zuvor in einem Methodenpapier auf45.

Tiere, die aufgrund einer hellen, spärlichen EGFP-Expression im Sehnervengewebe ausgewählt wurden, wurden in isolierte Vertiefungen gegeben, die D-Serin oder Kontrollaufzuchtmedium enthielten. 24 Stunden später wurde das Aufzuchtmedium aufgefrischt und 48 Stunden nach dem Screening (entsprechend Tag 2 der täglichen Bildgebung, Stadium 48) wurden die Tiere fotografiert. Kaulquappen wurden 3–5 Minuten lang in 2 mM Pancuroniumbromid (Tocris) getaucht, in 0,8 % w/v UltraPure-Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf einer Petrischale eingebettet und die Petrischale mit Aufzuchtmedium gefüllt.

Dendritische Dorne wurden mit einem Olympus XLUMPlanFLN 20X Wasserimmersionsobjektiv (1,0 NA) abgebildet, das auf einem kommerziellen Hochgeschwindigkeits-Multiphotonenmikroskop auf Resonanzscannerbasis (Thorlabs) mit piezoelektrischer Objektivfokussierung (Physik Instrumente) montiert war. Optische Schnitte der Z-Serie wurden in Abständen von 1 µm mit der ThorImage-Software (Version 3.0 +) gesammelt. Nachdem ein erstes Bild aufgenommen wurde (Zeitpunkt 0 Minuten), wurden 1 Stunde lang alle 10 Minuten Bilder gesammelt, während dem Tier 10 ms lang Vollfeldlicht präsentiert wurde, das von einer roten Luxeon-LED mit 1 Hz blinkte. Diese stroboskopische visuelle Stimulation wurde von einem Arduino Uno R3-Board und einem benutzerdefinierten Matlab-Skript gesteuert. Alle Bild-Z-Stapel wurden mit CANDLE entrauscht, der vierdimensionalen manuellen Rekonstruktion für die dynamische morphometrische Analyse, die mit der in MATLAB48 implementierten Dynamo-Software durchgeführt wurde, und mit einem benutzerdefinierten Python-Skript https://github.com/fieryzarzar/morphology_timecourse_analysis analysiert.

Nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren49 wurden Tiere, die 48 Stunden lang in D-Serin oder Kontrollaufzuchtmedium aufgezogen wurden (entsprechend Tag 2 der täglichen Bildgebung, Stadium 48), in 0,02 % MS-222 anästhesiert und durch Eintauchen in 4 % Paraformaldehyd (Cedarlane/ EMS 15735-30-S) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur, überführt in eiskaltes 100 % Methanol und nachfixiert über Nacht bei – 20 °C. Die Proben wurden dann 1 Stunde lang in einer Lösung aus 100 mM Tris/HCl, pH 7,4, mit 100 mM NaCl gewaschen. Zur Infiltration und zum Kryoschutz wurden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 15 % Fischgelatine (Norland HP-03) mit 15 % Saccharose und anschließend in 25 % Fischgelatine mit 15 % Saccharose inkubiert. Die Proben wurden zum Kryoschneiden in eine Lösung aus 20 % Fischgelatine mit 15 % Saccharose eingebettet und eingefroren. Horizontalschnitte wurden mit einer Dicke von 20 µm auf einem Kryostat gesammelt und direkt auf Superfrost-plus-Objektträger (Fisher) montiert.

Die Schnitte wurden zur Antigengewinnung mit 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in PBS 3 Minuten lang bei Raumtemperatur verarbeitet. Die Objektträger wurden mit Blockierungslösung (10 % Rinderserumalbumin und 5 % normales Ziegenserum in PBS) inkubiert, gefolgt von Kaninchen-Anti-GluA1 (1:200; Abcam ab109450 RRID:AB_10860361) und Maus-Anti-SV2 (1:1000; Entwicklungsstudien). Hybridoma Bank sv2-2a RRID:AB_2315387) und markiert mit Sekundärantikörpern Alexa-555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:200; Invitrogen A-21428 RRID:AB_141784) und Alexa-647 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:200; Invitrogen A21236 RRID:AB_2535805). Konfokale Bilder des optischen Tectums wurden mit einem 20x/0,75 CS2-Objektiv auf einem konfokalen Leica SP8-Mikroskop aufgenommen.

Zur Synapsenquantifizierung wurde ein zuvor veröffentlichter Ansatz49 verwendet. Kurz gesagt, die Analyse wurde an den optischen Schnitten 3 μm unter der Schnittfläche des histologischen Schnitts in Feldern ohne übermäßige Gefäßversorgung oder Schnittunregelmäßigkeiten durchgeführt. 20 μm × 20 μm große Felder wurden aus der Neuropil-Region jeder abgebildeten tektalen Hemisphäre ausgewählt. Die Bilder wurden mit FIJI vorverarbeitet, mit Hintergrundsubtraktion (rollender Ball mit einem Radius von 10 Pixeln), dann Medianfilterung (Radius von 2 Pixeln) und anschließender automatischer Moments-Schwellenwertermittlung für jeden Kanal. Um Synapsen zu identifizieren, wurde das logische UND der Kanäle SV2 (präsynaptisch) und GluA1 (postsynaptisch) erstellt und anschließend die Funktion „Partikel analysieren“ mit dem Größenkriterium einer Fläche von 0,1–5,0 μm2 angewendet, um die Anzahl der Puncta mit prä- und postsynaptischer Markierung abzuschätzen . Die Analyse wurde blind gegenüber den experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Tiere, die auf helle, spärliche dsRed-Expression untersucht wurden, wurden 48 Stunden lang entweder in D-Serin oder D-Serin plus MK-801 oder in Kontrollaufzuchtmedium gezüchtet (entsprechend Tag 2 der täglichen Bildgebung, abgebildet im Stadium 48). Lebende Tiere wurden mit dem gleichen Aufbau wie für die tägliche Bildgebung abgebildet. Optische Schnitte der Z-Serie wurden in Abständen von 1 µm mit der Fluoview-Software (Version 5.0) sowohl für den roten (dsRed) als auch den grünen (PSD95-GFP) Kanal gesammelt. Alle Bild-Z-Stapel wurden mit der FIJI-Software unter Verwendung der Filterfunktionen Hintergrundsubtraktion (rollende Kugel 10 µm) und Median (Radius 2 µm) verarbeitet. Die Bilder wurden mit MaxEntropy und Moments Auto-Thresholding für die dsRed- bzw. PSD95-GFP-Kanäle binär gemacht. Zur Identifizierung von Synapsen wurde die Funktion „Partikel analysieren“ mit einem Größenkriterium von 0,1–5,0 μm2 angewendet, um mit PSD95-GFP markierte synaptische Puncta zu identifizieren. Das logische UND der beiden Kanäle unter Verwendung des dsRed-Kanals als dendritische Maske identifizierte synaptische Puncta innerhalb des definierten dendritischen Volumens. Zellsomata und Axone wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die Analyse wurde blind gegenüber den experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten Verfahrens1 wurden Tiere, die auf helle GCaMP6s und auf eine laterale Hälfte ihres Körpers beschränkte mCherry-Expression ausgewählt wurden, ab Stadium 37 auf D-Serin oder Kontrollaufzuchtmedium übertragen und eine Woche später im Stadium 48 abgebildet, da retinale Ganglienzellen ( RGC)-Axone erreichen das Tectum nach Stadium 3750.

Kaulquappen wurden durch Eintauchen in 2 mM Pancuroniumbromid und in 1 %iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einer speziellen Kammer mit einem Glasdeckfenster auf einer Seite immobilisiert, durch das das Tier auf einem LCD-Bildschirm dargestellte visuelle Reize sehen konnte. Die LCD-Anzeigefläche maß 6,5 cm (Breite) × 4 cm (Höhe). Die Kaulquappe wurde so positioniert, dass das Auge 2,2 cm vom Bildschirm entfernt war und auf die Mitte des unteren Randes des Anzeigebereichs ausgerichtet war. Von diesem Standpunkt aus umfasste der Anzeigebereich etwa 110° Sichtwinkel im Azimut und 80° in der Höhe.

Calciumfluoreszenzbilder wurden mit einem auf Hochgeschwindigkeitsresonanzscannern basierenden Zweiphotonenmikroskop (Thorlabs) mit piezoelektrischer Fokussierung (Physik Instrumente) eines 20-fachen Wasserimmersions-Nikon-Objektivs mit 1,0 numerischer Apertur aufgenommen. Für GCaMP6s wurde eine Anregungswellenlänge von 910 nm verwendet und das Emissionssignal wurde durch einen 525/50-Bandpassfilter gesammelt. Auf dem LCD-Bildschirm wurde ein Wratten-Filter Nr. 29 (Kodak) installiert, um zu verhindern, dass Licht vom Display das Kalziumsignal stört. Benutzerdefinierte MATLAB-Skripte basierend auf der Psychophysics Toolbox (RRID: SCR_002881)51,52,53 wurden verwendet, um die visuellen Reize zu generieren und die Reizpräsentation mit der Bilderfassung zu synchronisieren. Visuelle Reize wurden monokular präsentiert und das Kalziumsignal wurde vom Tectum kontralateral zum stimulierten Auge abgebildet. Bilder (512 × 512 Pixel, 0,496 µm pro Pixel) wurden von einem einzelnen optischen Abschnitt bei 15 Hz oder von drei bis vier optischen Abschnitten (mit ein bis zwei Flyback-Frames) bei 6 Hz gesammelt.

Die Verarbeitung und Analyse der Calcium-Bildgebungsdaten wurde mit benutzerdefinierten Skripten in MATLAB (RRID: SCR_001622) und Fiji (RRID: SCR_002285) durchgeführt. Für Analysen zum Vergleich zweier separater Aufnahmen wurden die Bilder mithilfe der MATLAB-Bibliotheksfunktion imregtform() oder des NoRMCorre-Algorithmus für nicht starre Bewegungskorrektur54 ausgerichtet.

Die Gesichtsfelddarstellung im Tectum wurde dann mit „Grid Mapping“1 geschätzt. Kurz gesagt, dem Tier wurden nach dem Zufallsprinzip vertikale oder horizontale dunkle Balken mit einer Breite von 18° an fünf äquidistant beabstandeten Positionen entlang der Azimut- bzw. Elevationsachse präsentiert. Für jedes Pixel wurde eine „optimale Reizposition“ basierend auf der gewichteten durchschnittlichen ΔF/Fo-Reaktion des Pixels auf jede Reizposition berechnet, um die Mitte des Empfangsfelds des Pixels abzuschätzen. Zellkörper-ROIs wurden automatisch mit Cellpose55 segmentiert und die ∆F/Fo-Antworten wurden innerhalb jedes ROI gemittelt. „Rezeptive Feldschärfe“ wurde als durchschnittliche ∆F/Fo-Reaktion auf die beiden Reizpositionen, die der „optimalen Reizposition“ am nächsten liegen, dividiert durch die durchschnittliche Reaktion auf die verbleibenden Reizpositionen in der Peripherie quantifiziert. Es wurden nur Zellkörper mit maximaler Reizantwort ∆F/Fo > 2 und optimalen Reizpositionen, die zwischen den drei zentralen Reizpositionen lagen, bewertet. Zellkörper, die kleiner als 30 Pixel waren, und Tiere mit weniger als 30 Zellkörpern, die den Bewertungskriterien entsprachen, wurden ausgeschlossen.

Die Analysen wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Statistische Analysen wurden in GraphPad Prism 8.0 durchgeführt. Die Normalität der Datenverteilungen wurde mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests bestätigt. Die Details zu den statistischen Tests für jedes Experiment finden Sie in den Legenden der Abbildungen. Alle Quantifizierungen werden als Mittelwert ± SEM grafisch dargestellt, sofern nicht anders angegeben (Ergänzende Informationen).

Der benutzerdefinierte Code ist auf Github für die Dynamik dendritischer Filopodien https://github.com/fieryzarzar/morphology_timecourse_analysis und für die Retinotopenkartierung https://github.com/RuthazerLab/XenMap verfügbar.

Um die dendritische Laubenmorphologie von Neuronen im optischen Tektum sichtbar zu machen, haben wir Tektalzellen elektroporiert, um EGFP nur spärlich zu exprimieren, und dann vier Tage lang täglich eine Zwei-Photonen-Bildgebung in vivo durchgeführt. Nach dem Sammeln von Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop-Basisbildern von einzeln markierten tektalen Neuronen (Tag 0, Stadium 46–47) wurden die Tiere in 100 μM D-Serin aufgezogen, was die retinotektalen NMDAR-Ströme verstärkt43. In den folgenden drei Tagen (Stadium 48) wurden die Zellen alle 24 Stunden abgebildet (Abb. 1A, B). Bei Neuronen mit anfänglich weniger ausgereiften dendritischen Dornen (< 500 μm anfängliche Dornlänge), jedoch nicht bei Neuronen mit größeren Dornen (≥ 500 μm), beobachteten wir eine signifikante Verringerung der dendritischen Dornlänge bei mit D-Serin aufgezogenen Tieren im Vergleich zu Kontrollen, offensichtlich durch um 2 Tage (Abb. 1C), aber keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der dendritischen Zweigspitzen (Abb. 1D). Wir haben unsere morphologische Analyse daher auf unreife Neuronen konzentriert.

CREMSCLE ist eine Bulk-Elektroporationsmethode für spärliche Markierung, die auf der Co-Elektroporation von Cre-Rekombinase mit niedriger Konzentration und Floxed-Stop-EGFP-Plasmiden45 basiert. Da das Plasmid in den Hirnventrikel injiziert wird, markiert es bevorzugt kürzlich differenzierte, unreife Zellen in der Nähe der periventrikulären Proliferationszone des Tektums. Die Sholl-Analyse dieser anfänglich unreifen Neuronen ergab, dass eine dreitägige D-Serin-Aufzucht die Entwicklung des dendritischen Dorns weit entfernt vom Zellkörper im Vergleich zu Zellen in Kontrolltieren verringerte (Abb. 1E). Insgesamt entwickelten sich unreife Neuronen, die D-Serin ausgesetzt waren, kompakter als die Kontrollen.

Wachstum dendritischer Dornen tektaler Zellen bei Tieren, die über 4 Tage in D-Serin aufgezogen wurden. (A) Experimentelles Design. Kaulquappen im Stadium 42–44 wurden elektroporiert, 48 Stunden später im Stadium 46–47 auf Einzelzell-GFP-Expression untersucht und die GFP+-Zelle wurde täglich abgebildet. Nach einem Basisbild am Tag 0 wurden die Tiere in Kontroll- oder D-Serin-Medium aufgezogen und drei weitere Tage lang täglich Bilder gesammelt. (B) Z-Projektionen repräsentativer tektaler Neuronen. Maßstabsleiste: 20 µm. (C, D) Quantifizierung der (C) Länge und (D) Anzahl der Spitzen der dendritischen Dorne von Kaulquappen, die in D-Serin (rote Quadrate) aufgezogen wurden, im Vergleich zur Kontrolle (schwarze Kreise), unterteilt in unreife (Gesamtlänge des dendritischen Dorns). < 500 µm am Tag 0) oder reif (≥ 500 µm am Tag 0). Unreife Zellen wurden durch CREMSCLE und reife Zellen durch Einzelzellelektroporation markiert. Bei unreifen Zellen waren die Gesamtlänge des dendritischen Dorns und die Anzahl der Zweigspitzen in D-Serin im Vergleich zur Kontrolle reduziert. [RM-ANOVA-Interaktion *p < 0,05, Šídáks Mehrfachvergleiche Post-hoc-Test Tag 2 **p < 0,005, Tag 3 *p < 0,05. 1 Zelle pro Tier, unreife Zellen: n = 6 Zellen für D-Serin, n = 9 für die Kontrolle, reife Zellen: n = 4 Zellen für beide Gruppen] (E) Sholl-Analyse von CREMSCLE-Zellen zeigt, dass die tektale dendritische Verzweigung näher an der erfolgt Soma bei Tieren, die in D-Serin aufgezogen wurden. [Multiplizitätskorrigierte RM-ANOVA-Wechselwirkung, Tag 3 p < 0,0005, Šídáks Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche ****p < 0,0001. 1 Zelle pro Tier analysiert mit n = 9 Zellen für D-Serin, n = 6 für die Kontrolle].

Wir stellten die Hypothese auf, dass diese morphologischen Unterschiede auf eine vorzeitige Stabilisierung der dendritischen Dorne unreifer Neuronen in D-Serin zurückzuführen sein könnten. Um diese Idee zu testen, wurde die Verzweigungsdynamik mit Kurzintervall-Bildgebung alle 10 Minuten für 1 Stunde bei Tieren untersucht, die einer visuellen Stimulation in Form von 1-Hz-Stroboskopblitzen („Stroboskop“) ausgesetzt waren. Da die tägliche Bildgebung einen signifikanten Einfluss auf die Laubenlänge durch 48-stündige D-Serin-Exposition zeigte (Abb. 1C), haben wir als nächstes die dynamische Umgestaltung dendritischer Lauben bei Kaulquappen im Stadium 48 abgebildet, die 48 Stunden lang in D-Serin aufgezogen worden waren (Abb. 2A,B). Dendritische Prozesse wurden als Filopodien (< 10 µm Länge) oder Zweige (> 10 µm) kategorisiert und separat analysiert, da gezeigt wurde, dass diese dendritischen Kompartimente unterschiedliche Zytoskelettelemente, aktivitätsabhängiges Wachstum und Verbindungen zur Synaptogenese aufweisen48,56.

Filopodien und Verzweigungsdynamik dendritischer Lauben von Tektalzellen bei Tieren, die 48 Stunden lang in D-Serin aufgezogen wurden. (A) Experimentelles Design. Kaulquappen im Stadium 42–44 wurden elektroporiert, 48 Stunden später im Stadium 46–47 auf GFP-Expression untersucht und 48 Stunden lang bis zum Stadium 48 in Kontroll- oder D-Serin-Medium aufgezogen. Nach dem ersten Bild wurden die Zellen alle 10 Minuten abgebildet 1 Stunde lang, während Kaulquappen mit 1-Hz-Stroboskopblitzen visuell stimuliert wurden. (B) Repräsentative Bilder von dendritischen Dornen während der Bildgebung und ein abschließendes zusammengeführtes Bild, das die Zeitpunkte 0 (Magenta) und 60 (Gelb) Minuten überlagert. Maßstabsleiste: 10 µm. (C) Dichte der pro Zeitpunkt gezählten Prozesse für Filopodien (dendritische Prozesse < 10 µm Länge; schattiert) und Zweige (≥ 10 µm Länge; nicht schattiert) von Kontrolldornen (schwarz) und D-Serindornen (rot). Die Dichte wurde als Anzahl der dendritischen Fortsätze dividiert durch die Dornlänge berechnet. (D) Anzahl der Filopodien, die über 1 Stunde Bildgebung zur dendritischen Laube hinzugefügt wurden. (E) Die Anzahl der verlorenen Filopodien zeigte im Vergleich zur Kontrolle einen Trend zu einer Abnahme der D-Serin-Dornen. [t-Test #p = 0,06] (F) Länge der Filopodienverlängerungen und (G) Retraktionen über 1 Stunde Bildgebung. (H) Filopodienmotilität (Summe der Dehnungen und Retraktionen) pro Zeitpunkt. (I–M) Quantifizierung für Zweige, einschließlich der über 1 Stunde hinzugefügten (I) und (J) verlorenen Anzahl. (K) Die Zweige zeigten in D-Serin-Dornen im Vergleich zur Kontrolle einen Trend zur Verlängerung um weniger als 1 Stunde. [t-test #p = 0,06] (L) Die Länge der Astrückzüge über 1 Stunde war in der D-Serin-Gruppe signifikant geringer [t-test *p < 0,05], ebenso wie die (M)-Astmotilität pro Zeitpunkt [RM ANOVA-Haupteffekt der Behandlung *p < 0,05]. 1 Zelle pro Tier analysiert mit n = 6 für D-Serin, n = 7 für die Kontrolle.

Die Aufzucht von D-Serin schien die Gesamtdichte dendritischer Prozesse (Anzahl der Prozesse dividiert durch Dornlänge) nicht zu verändern, unabhängig davon, ob es sich bei den Prozessen um Filopodien oder Zweige handelte (Abb. 2C). Die Gesamtzahl der hinzugefügten und verlorenen Filopodien (Abb. 2D, E) und Zweige (Abb. 2I, J) unterschied sich zwischen mit D-Serin aufgezogenen und Kontrolllauben nicht signifikant, obwohl ein Trend zu weniger dynamischen Ereignissen bei mit D-Serin aufgezogenen Bäumen zu verzeichnen war Tiere waren offensichtlich. Wir haben außerdem die Filopodien- und Astverlängerungen (Abb. 2F, K) und Retraktionen (Abb. 2G, L) im Laufe der Stunde sowie deren Gesamtmotilität pro Zeitpunkt (Abb. 2H, M) quantifiziert. Die Quantifizierung des Filopodienwachstums zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (Abb. 2F, G). Allerdings zeigten dendritische Äste bei mit D-Serin aufgezogenen Tieren einen Trend zu einer geringeren Verlängerung (Abb. 2K) und zeigten im Verlauf der Bildgebungsstunde eine deutlich geringere Retraktion (Abb. 2L). Insgesamt reduzierte die D-Serin-Exposition die Zweigmotilität pro Zeitpunkt über die Stunde der Bildgebung deutlich (Abb. 2M). Diese Beobachtungen der Dorndynamik legen nahe, dass dendritische Äste, die chronisch D-Serin ausgesetzt sind, eine geringere Tendenz haben, sich bei visueller Stimulation zu verlängern und zurückzuziehen, was zu dendritischen Dornen führt, die im Laufe der Zeit stabiler sind. Bemerkenswert ist, dass die Auswirkungen von D-Serin auf die Stabilisierung in reiferen Prozessen (Verzweigungen) beobachtet werden, die mit größerer Wahrscheinlichkeit Synapsen tragen. Diese Beobachtungen stützen die Hypothese, dass eine Verstärkung der NMDAR-Signalübertragung zu einer Hyperstabilität des dendritischen Dorns führt.

Da die Morphogenese dendritischer Zweige durch die D-Serin-Aufzucht beeinflusst wurde, untersuchten wir als nächstes, ob möglicherweise auch die Synaptogenese beeinflusst wird. Wir untersuchten die Auswirkungen von chronischem D-Serin auf die Synapsendichte mithilfe einer immunhistochemischen Markierung von präsynaptischen (SV2) und postsynaptischen (GluA1) Markern auf Kryostatabschnitten des Sehnervengewebes von Tieren, die 48 Stunden lang in D-Serin aufgezogen wurden (von Stadium 46–47 bis zum Stadium). 48). Die Quantifizierung „anatomischer Synapsen“ basierte auf der überlappenden Gegenüberstellung dieser prä- und postsynaptischen Marker in konfokalen Bildern des tektalen Neuropils49. Wir fanden heraus, dass die anatomische Synapsendichte im tektalen Neuropil nach zweitägiger D-Serin-Exposition signifikant erhöht war (Abb. 3A–C).

Zusammengenommen legen unsere Beobachtungen von kompakteren, stabileren dendritischen Dornen und einer erhöhten Synapsenzahl im tektalen Neuropil von mit D-Serin aufgezogenen Tieren nahe, dass ihre einzelnen tektalen Dendriten eine erhöhte Dichte an synaptischen Eingaben aufweisen sollten. Wir haben daher Tektalzellen im Stadium 42–44 elektroporiert, um das mit EGFP fusionierte synaptische Marker-Protein 95 der postsynaptischen Dichte (PSD95-GFP) zusammen mit einer spärlichen Einzelzellexpression von dsRed durch CREMSCLE zu exprimieren. Tiere mit geeigneter Markierung wurden dann 48 Stunden lang in d-Serin enthaltendem Medium aufgezogen (Abb. 3D). Die Quantifizierung der PSD95-GFP-Punctum-Dichte in dsRed-markierten Neuronen bestätigte, dass mit D-Serin aufgezogene Zellen eine signifikant größere Anzahl synaptischer Puncta pro dendritischem Volumen aufwiesen (Abb. 3E, F). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass D-Serin über Nicht-NMDA-Rezeptorziele, wie etwa synaptogene Glutamat-Delta-Rezeptoren57,58, wirkt, wurden einige Tiere in D-Serin plus dem NMDAR-Kanalblocker MK-801 (10 µM) aufgezogen. Die Zugabe von MK-801 verhinderte den Anstieg der Synapsendichte, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Wirkung von D-Serin NMDAR-abhängig ist.

Synaptische Dichte im Tectum von Tieren, die 48 Stunden lang in D-Serin aufgezogen wurden. (A) Experimentelles Design: Kaulquappen im Stadium 46–47 wurden 48 Stunden lang bis zum Stadium 48 in Kontroll- oder D-Serin-Medium aufgezogen, dann fixiert, geschnitten und für die konfokale Bildgebung auf SV2 und GluA1 immungefärbt. (B) Kolokalisierte Puncta von SV2 (präsynaptisch) und GluA1 (postsynaptisch) Immunfluoreszenz auf Gehirnschnitten. Für ein Probenfeld wird (i) das tektale Neuropil gezeigt, (ii) in einen gestrichelten 20 µm × 20 µm großen Interessenbereich hineingezoomt (oben) mit automatisierter Verarbeitung zur Identifizierung „anatomischer Synapsen“ (unten, weiße Überlagerung, siehe). "Materialen und Methoden"). (C) Die anatomische Synapsendichte im optischen Tectum war bei Tieren, die in D-Serin aufgezogen wurden, signifikant erhöht. [t-Test *p < 0,05. Es wurden 2–3 Felder pro tektaler Hemisphäre analysiert, d. h. mindestens 5 Felder pro Tier von n = 5 d-Serin, 3 Kontrolltiere]. Es wurden nur kolokalisierte Puncta einbezogen, die dem Kriterium der Synapsengröße von 0,1–5,0 µm2 entsprachen. (D) Experimentelles Design: Kaulquappen im Stadium 42–44 wurden elektroporiert, 48 Stunden später im Stadium 46–47 auf dsRed- und PSD95-GFP-Expression untersucht und in Kontroll-, D-Serin- oder D-Serin + MK-801-Medium aufgezogen 48 h und im Stadium 48 abgebildet. (E) Vergrößerte dendritische Dorne tektaler Neuronen, die PSD95-GFP + puncta (gelb) in dsRed + -Zellen (magenta) exprimieren. Maßstabsleiste: 10 µm. Pfeile: Beispiele für synaptische Puncta. (F) Die Quantifizierung der Dichten von PSD-95-Punkten pro Volumen der dendritischen Laube für einzelne tektale Neuronen zeigt, dass die Aufzucht in D-Serin die Synapsendichte erhöht, was verhindert wird, wenn NMDARs durch MK-801 blockiert werden. [Einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche **p < 0,01, *p < 0,05. n = 6 Kontrolle, 10 D-Serin, 8 D-Serin + MK-801-Zellen].

Um zu untersuchen, wie die Aufzucht von D-Serin die Entwicklung der Retinotopenkarte verändern kann, verwendeten wir Kalziumbildgebung mit visueller Stimulation, um funktionelle topografische Karten in den optischen Tekta von Kaulquappen zu extrahieren, die in D-Serin oder Kontrollmedien aufgezogen wurden (Abb. 4A). Wir führten mRNA-Injektionen in ein Blastomer im Zwei-Zellen-Entwicklungsstadium durch, um hemilaterale Mosaikkaulquappen zu erzeugen, die GCaMP6s auf einer Seite des Tieres exprimierten und so Tektalzellen markierten, nicht jedoch die RGC-Axone, die sie vom kontralateralen Auge aus innervierten. Die Tiere wurden im Stadium 48 abgebildet, nachdem sie ab Stadium 37 in D-Serin aufgezogen wurden. Dies deckt den Entwicklungszeitraum ab, in dem RGC-Axone zum ersten Mal ankommen, um das Tectum zu innervieren50. Zwei-Photonen-Kalzium-Reaktionen des optischen Tectums wurden aufgezeichnet, während rezeptive Feldkartierungsreize präsentiert wurden.

Um die Reaktionseigenschaften einzelner Tektalneuronen zu messen, die die Retinotopenkarte bilden, wurde Kaulquappen ein dunkler Balken auf einem hellen Hintergrund präsentiert, der wiederholt in zufälliger Reihenfolge an einer von fünf Positionen entlang der Azimut- oder Höhenachse erschien. Einzelne Zellsomata wurden aus den Zwei-Photonen-Bildern segmentiert und das Empfangsfeldzentrum für jeden tektalen Zellkörper wurde basierend auf der relativen Stärke der Reaktionen auf die Reize in jeder der 5 Positionen geschätzt (Rasterkarte; Abb. 4B, C). .

Wir haben die „Empfangsfeldschärfe“ einzelner Tektalzellen quantifiziert, um ihre Empfangsfeldgröße abzuschätzen, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie durch die NMDAR-Blockade vergrößert wird1,59. Die Schärfe des Empfangsfeldes ist definiert als die durchschnittliche Fluoreszenzänderung bei Reizen, die an den optimalen Reizpositionen präsentiert werden, geteilt durch die mittlere Reaktion auf die Stimulation der verbleibenden nicht optimalen Reizpositionen für Azimut (Abb. 4B, D) und Elevation (Abb. 4C,E) Achsen. Ein höherer Schärfewert des Empfangsfeldes deutet auf ein kompakteres Empfangsfeld hin. Im D-Serin-Zustand kam es zu einer signifikanten Rechtsverschiebung der kumulativen Wahrscheinlichkeitsverteilungen der Empfangsfeldschärfe, insbesondere in der Höhenachse. Unsere Daten deuten daher darauf hin, dass die Aufzucht von D-Serin zu kompakteren visuellen Empfangsfeldern für tektale Neuronen führt, was mit einer Dornverdichtung und einer erhöhten Synapsendichte der Dendriten tektaler Zellen vereinbar ist.

Postsynaptische Retinotopenkarten bei Tieren im Stadium 48, die ab Stadium 37 in D-Serin aufgezogen wurden. (A) Versuchsaufbau. mRNA für GCaMP6s wurde im Zweizellstadium in ein Blastomer injiziert, um Kaulquappen zu erzeugen, deren Mosaik-GCaMP6s-Expression auf die Hälfte des Tieres beschränkt war. Kaulquappen wurden im Stadium 37 auf GCaMP6s-Expression untersucht und dann im Kontrollstadium oder in D-Serin für die Zwei-Photonen-Bildgebung der Calciumfluoreszenz im Sehnervengewebe im Stadium 48 aufgezogen. Maßstabsbalken: 50 µm. (B, C) Repräsentative Bilder, die die Standorte des Empfangsfeldzentrums (links) und die Schärfe des Empfangsfelds (rechts) einzelner Tektalzellen als Reaktion auf einen Balken zeigen, der an jedem der 5 Standorte entlang der Azimut- und (C) Elevationsachse (B) aufblitzte. Die Karten sind anhand der optimalen Reizposition, die in jeder Zelle eine Reaktion hervorruft, farblich gekennzeichnet. Maßstabsbalken: 50 µm. (D, E) Kumulative Wahrscheinlichkeitsverteilungen der Empfangsfeldschärfe von Tektalzellkörpern bei einzelnen Tieren (hellere Linien) und gruppiert nach Behandlung (dunklere Linien) für den (D)-Azimut [n = 365 Zellen von 6 Tieren für D-Serin, n = 181 Zellen von 5 Tieren zur Kontrolle] und (E) Höhenachsen [n = 326 Zellen von 6 Tieren für D-Serin, n = 172 Zellen von 5 Tieren zur Kontrolle. Kolmogorov-Smirnov-Test für gepoolte Werte *p < 0,05].

Unsere Studie untersuchte die Auswirkungen der chronischen Verabreichung sättigender Mengen des NMDAR-Co-Agonisten D-Serin auf die morphologische Entwicklung des retinotektalen Kreislaufs. Wir beobachteten, dass dendritische Dorne von unreifen Neuronen, die D-Serin ausgesetzt waren, eine kompaktere Morphologie aufwiesen, was wahrscheinlich auf eine verbesserte Stabilisierung der dendritischen Dorne zurückzuführen ist, und dass sie eine höhere Synapsendichte aufwiesen. Funktionell zeigte die Kalziumbildgebung kompaktere rezeptive Felder tektaler Neuronen bei Tieren, die mit D-Serin aufgezogen wurden. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass im sich entwickelnden retinotektalen Kreislauf die Maximierung der aktivitätsabhängigen NMDAR-Signalübertragung durch sättigende D-Serin-Spiegel zu einer strukturellen Kompression der dendritischen Dorne tektaler Zellen führt, so dass diese umfangreicher aus einem räumlich gruppierteren Satz von Eingaben abtasten.

Unsere morphologischen Beobachtungen eines verringerten Dendritenwachstums unter Bedingungen der NMDAR-Verstärkung durch D-Serin-Verabreichung waren zunächst überraschend, da frühere Berichte berücksichtigten, dass die NMDAR-Blockade mit APV in vivo auch das Dendritenwachstum über 24 Stunden reduzierte16 und die Größe und Dynamik der dendritischen Zweige über 2 Stunden Bildgebung verringerte17 . Unsere Ergebnisse stimmen jedoch mit Beobachtungen in anderen Modellsystemen überein, beispielsweise im visuellen Thalamus des Frettchens, wo die Größe des dendritischen Dorns und die Wirbelsäulendichte als Reaktion auf eine Woche APV-Verabreichung zunahmen14. Im Säugetierhomolog des Tectums, dem Colliculus superior, führt die NMDAR-Blockade zu einer weniger verfeinerten Innervation durch RGC-Axone13 und vergrößerten Empfangsfeldern60. In primären kortikalen Kulturen führt die Anwendung der endogenen negativen NMDAR-Modulatoren Kynurenat, Pregnenolonsulfat, Spermidin und Zink zu einer Erweiterung des dendritischen Dorns mit mehr distaler Verzweigung61. Die akute versus chronische Arzneimittelverabreichung kann für einige Diskrepanzen bei den beobachteten Wirkungen in den verschiedenen Studien verantwortlich sein. Darüber hinaus können verschiedene pharmakologische Wirkstoffe bevorzugt auf unterschiedliche Zellkompartimente wirken. Beispielsweise führt der GluN1-Knockdown in postsynaptischen Tektalzellen zu weniger dendritischen Verzweigungen im Vergleich zu Zellen, in denen der GluN1-Knockdown auf ihre präsynaptischen RGC-Eingänge abzielt21.

In der aktuellen Studie berichten wir, dass die Steigerung der NMDAR-Aktivität mit D-Serin über 48 Stunden zu einer verminderten Arbor-Ausarbeitung führt. Dies steht im Einklang mit Erkenntnissen aus dem somatosensorischen System von Mäusen mit GluN1-Knockdown, bei denen Barrelette-Zellen, die Trigeminus-Whisker-Afferenzen empfangen, längere Dendriten ohne Orientierungsverzerrung entwickeln19. In ähnlicher Weise führt das Ausschalten von GluN1 in kortikalen erregenden Neuronen zu üppigen dendritischen Dornen in stacheligen Sternzellen, die ohne eine klare Ausrichtung auf die Fasszentren ausstrahlen62. Diese Tiere wiederum weisen gestörte Verzweigungsmuster der Whisker-Afferenzen auf19,20. Insgesamt stört der Verlust funktionsfähiger NMDARs die Schaltkreismuster im gesamten somatosensorischen System, von der Ebene des Hirnstamms15 bis zum Kortex22.

Hier fanden wir heraus, dass eine 48-stündige Steigerung der NMDAR-Aktivität mit D-Serin zu kompakteren und weniger dynamischen dendritischen Dornen führte, insbesondere in Neuronen mit anfänglich kleinen, unreifen Dornen. Unsere Ergebnisse, die Unterschiede zwischen Kontroll- und D-Serin-Bedingungen für dendritische Dornen zeigen, die anfänglich weniger ausgereift sind (< 500 μm anfängliche Dornlänge), nicht jedoch solche mit größeren Dornen (≥ 500 μm), erinnern an Erkenntnisse aus früheren Experimenten mit CaMKIIα. Diese Experimente zeigten, dass die Überexpression von CaMKIIα, einem Schlüsseleffektor stromabwärts des NMDAR, auch das dendritische Wachstum unreifer, jedoch nicht reiferer Neuronen verlangsamt63. Somit scheint die NMDAR-Aktivität das Wachstum zu begrenzen und die Dornen unreiferer Neuronen zu stabilisieren, was möglicherweise als aktivitätsabhängiger Mediator der neuronalen Reifung fungiert.

Um besser zu verstehen, wie die Koinzidenzerkennung durch NMDARs neuronale Aktivität in Hinweise zur topografischen Verfeinerung umwandelt, bestand ein Ansatz darin, sensorische visuelle Erfahrungen zu manipulieren, um gemusterte neuronale Aktivität zu induzieren und ihre Auswirkungen in Echtzeit zu untersuchen9. Insbesondere kann die stroboskopische visuelle Stimulation verwendet werden, um die Aktivität im retinotektalen System physiologisch zu steuern64. Unter Stroboskopstimulation führte eine verstärkte NMDAR-Signalübertragung in unreifen Neuronen, die 48 Stunden lang D-Serin ausgesetzt waren, zu einer Stabilisierung der Dynamik der dendritischen Verzweigungen. Diese verringerte Zweigmotilität ist wahrscheinlich für die kompaktere dendritische Dornmorphologie verantwortlich, die wir nach 48-stündiger D-Serin-Exposition beobachteten.

Es wird angenommen, dass die dendritische Morphologie mit den Synapsen selbst zusammenhängt. Die Verschiebung von kleinen, einfachen Dornen zu größeren, komplexeren Dornen mit zunehmender Neuronenreife entspricht der gut charakterisierten Verschiebung von der überwiegend NMDAR-vermittelten glutamatergen Neurotransmission, die für unreife Synapsen typisch ist, zur sowohl AMPAR- als auch NMDAR-vermittelten Neurotransmission an reifen Synapsen65,66. Zellen mit kürzeren dendritischen Dornen (< 200 μm Länge) weisen tendenziell ein geringeres AMPA/NMDA-Verhältnis auf als Zellen mit größeren Dornen (> 200 μm Länge)16. Tatsächlich legt Vaughns synaptotrope Hypothese nahe, dass die Zweigstabilität durch das Vorhandensein einer stabilen Synapse verliehen werden könnte67,68. Live-Bildgebung von PSD-95-markierten Synapsen in tektalen Neuronen von Zebrafischen zeigte, dass es sich dabei um Orte der dendritischen Stabilisierung handelt, von denen aus sukzessive Verzweigungen und Wachstum stattfinden69. Hier berichten wir über eine erhöhte PSD-95-Punktumdichte nach D-Serin-Exposition. Die Beobachtung, dass die D-Serin-Dorne kompakter sind und dennoch eine erhöhte synaptische Dichte aufweisen, legt nahe, dass postsynaptische tektale Neuronen möglicherweise eine homöostatische Regulierung des gesamten synaptischen Inputs erfahren.

Wir entschieden uns für die Verwendung von D-Serin anstelle von Glycin als spezifischeren NMDAR-Co-Agonisten in diesen Experimenten, da Glycin eine bekannte Rolle als inhibitorischer Neurotransmitter im retinotektalen System spielt70. Es wurde jedoch auch berichtet, dass D-Serin an Glutamatrezeptoren vom Delta-Typ bindet, um die Synaptogenese zu fördern57,58. Wir glauben, dass die Auswirkungen der D-Serin-Aufzucht in unserer Studie durch NMDARs vermittelt wurden, da sie durch die Zugabe des NMDAR-Porenblockers MK-801 gerettet wurden (Abb. 3F). Darüber hinaus haben unsere früheren Arbeiten eine elektrophysiologische Verstärkung der AMPAR-vermittelten Ströme ohne verbleibende Änderung der NMDAR-Ströme in tektalen Neuronen von Xenopus nach dem Auswaschen des Arzneimittels nach 48-stündiger D-Serin-Aufzucht gezeigt. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Auswirkungen von D-Serin auf tektale Neuronen höchstwahrscheinlich durch NMDARs vermittelt werden und dass die Exposition von Kaulquappen gegenüber sättigenden D-Serin-Spiegeln nicht zu einer chronischen NMDAR-Internalisierung führt.

Diese NMDAR-bedingten Veränderungen der Morphologie stehen im Zusammenhang mit der Entwicklung und Pflege von Retinotopenkarten. Eine chronische NMDAR-Blockade führt zu einer Verschlechterung der RGC-Projektionskonvergenz innerhalb des optischen Tectums12 und zur Aufhebung der Augendominanzbänder in doppelt innervierten Tecta bei Amphibien7,71. Die NMDAR-Blockade führt auch zu einer funktionellen Vergrößerung der visuellen Empfangsfelder im Xenopus tectum1,59. Eine chronische pharmakologische Blockade von NMDARs im visuellen Kortex von Kätzchen, die einer monokularen Deprivation ausgesetzt waren, verhinderte den Verlust der Reaktionsfähigkeit auf das deprivierte Auge72. Darüber hinaus verhindert die chronische Hemmung der GluN1-Translation durch Antisense-Infusion während der Entwicklung die Reifung der Orientierungsselektivität im primären visuellen Kortex des Frettchens73. Insgesamt deuten diese Beweislinien darauf hin, dass eine angemessene Regulierung der NMDAR-Signalübertragung wichtig für die präzise Ausrichtung von Axonen auf ihre dendritischen Partner, die Stärkung geeigneter Synapsen und letztendlich für die Kartenverfeinerung ist. Unsere Experimente, die die synaptisch hervorgerufene NMDAR-Aktivität verstärkten, anstatt sich auf eine pharmakologische Blockade oder einen pharmakologischen Abbau zu verlassen, bestätigen und erweitern die Schlussfolgerungen dieser Studien zum Einfluss der NMDAR-Aktivität auf die dendritische Morphogenese.

Die NMDAR-Aktivität spielt auch eine wichtige Rolle bei der Feinabstimmung der Funktionseigenschaften im Schaltkreis. Durch die Untersuchung der Eigenschaften des tektalen Rezeptionsfelds mittels Calcium-Bildgebung konnten wir feststellen, dass die Aufzucht von Tieren in D-Serin die Schärfe des Rezeptionsfelds einzelner Neuronen erhöhte, ohne die Organisation der groben topografischen Karte zu stören. Dieser Befund ergänzt frühere Arbeiten, in denen die elektrophysiologisch59 oder durch Kalziumbildgebung1 gemessenen optischen tektalen Empfangsfelder von Xenopus infolge einer chronischen NMDAR-Blockade während der Phase der Verfeinerung des Empfangsfeldes vergrößert wurden. Wir schlagen daher vor, dass die NMDAR-Verstärkung durch D-Serin-Exposition zwar die gesamte topografische Organisation, die größtenteils durch molekulare Orientierungssignale74,75 bestimmt wird, nicht grob stört, dass sie jedoch die synaptische Plastizität moduliert und zu lokalen Veränderungen der retinotopischen Reaktionseigenschaften tektaler Neuronen führt. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass nicht-visuelle Eingaben aus dem Hinterhirn auf die proximaleren Dendriten abzielen und sich durch einen NMDAR-abhängigen Mechanismus von visuellen Eingaben trennen76. Da wir anhand der Sholl-Analyse festgestellt haben, dass die D-Serin-Exposition zu kompakteren Dornen führt, die sich tiefer im tektalen Neuropil entwickeln, könnten weitere Untersuchungen zeigen, ob die NMDAR-Signalverstärkung durch D-Serin unterschiedliche Auswirkungen auf visuelle und nicht-visuelle Eingaben hat.

Schließlich wird es wichtig sein zu untersuchen, ob endogen freigesetztes D-Serin sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als Regulator der Plastizität des Kreislaufs fungiert. Da angenommen wird, dass die Synthese und Freisetzung von D-Serin gemeinsam durch Neuronen77 und Glia, insbesondere Astrozyten39, reguliert wird, deutet dies auf einen Metaplastizitätsmechanismus hin, bei dem die durch Astrozyten regulierte Verfügbarkeit von D-Serin an glutamatergen Synapsen die NMDAR-vermittelte Plastizität moduliert. Aberrante Veränderungen in der NMDAR-Aktivierung sowie der D-Serin-Synthese und -Verfügbarkeit wurden mit Neuroinflammation und Exzitotoxizität bei Alzheimer, amyotropher Sklerose, Ischämie und Schizophrenie in Verbindung gebracht44,78. Es wurde vermutet, dass die D-Serin-Regulation in bestimmten pathologischen Zuständen abnormal ist, und derzeit laufen klinische Studien, die auf D-Serin sowie seine Biosynthese- und Regulierungswege für therapeutische Zwecke abzielen39,40. Das Verständnis der Signalwege und präzisen Mechanismen, durch die D-Serin Struktur und Funktion beeinflusst, wird wichtige Einblicke in die erfahrungsabhängige NMDAR-vermittelte Plastizität sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit liefern.

Der benutzerdefinierte Code ist auf Github für die Dynamik dendritischer Filopodien https://github.com/fieryzarzar/morphology_timecourse_analysis und für die Retinotopenkartierung https://github.com/RuthazerLab/XenMap verfügbar. Code für die CANDLE-Rauschunterdrückung finden Sie unter https://sites.google.com/site/pierrickcoupe/softwares/denoising/multiphoton-image-filtering.

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Die konfokale Bildgebung wurde in der Neuro Microscopy Core Facility durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch einen Chaire de recherche des Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS Grant 31036) und einen Foundation Grant der Canadian Institutes of Health Research (CIHR FDN-143238) an ER und das McGill University Integrated Program in Neuroscience finanziert Stipendien für ZC und VJL.

Montreal Neurological Institute-Krankenhaus und Abteilung für Neurologie und Neurochirurgie, McGill University, 3801 Rue University, Montréal, QC, H3A 2B4, Kanada

Zahra Chorghay, Vanessa J. Li, Anne Schohl und Edward S. Ruthazer

MILA, 6666 Rue St Urbain, Montreal, QC, H2S 3H1, Kanada

Arna Ghosh

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ZC und ESR konzipierten die Arbeit und verfassten das Manuskript. ZC führte und analysierte Experimente für Abb. 1, 2 und 3, und VL führte und analysierte Experimente für Abb. 4. AG unterstützte ZC bei der Codierung für die Datenanalyse für Abb. 2. AS generierte experimentelle Konstrukte und führte Experimente für Abb. 3E durch und F und leistete technischen Support. ESR sicherte die Finanzierung und überwachte die Forschung.

Korrespondenz mit Edward S. Ruthazer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chorghay, Z., Li, VJ, Schohl, A. et al. Die Auswirkungen des NMDAR-Co-Agonisten D-Serin auf die Struktur und Funktion optischer tektaler Neuronen im sich entwickelnden visuellen System. Sci Rep 13, 13383 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39951-4

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Eingegangen: 27. März 2023

Angenommen: 02. August 2023

Veröffentlicht: 17. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39951-4

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